海洋微生物小分子代谢产物提取制备工艺研究

【摘要】本论文主要是以海洋微生物发酵液为研究对象,探索海洋微生物小分了代谢产物高效率、高通量的提取和制备分离方法,建立海洋微生物小分子代谢产物馏分库以供活性药物的初步筛选,为最终建立海洋微生物小分子代谢产物活性化合物库奠定基础。具体内容如下：第一：为提高过滤速率,对海洋细菌和放线菌发酵液进行预处理研究,主要以海洋细菌发酵液为研究对象,采用絮凝技术对发酵液进行预处理。以610nm透光率、蛋白去除率、多糖去除率、过滤速度等为指标,从8种不同类型的絮凝剂中筛选出适合的絮凝剂,通过HPLC分析比较了两种絮凝剂对发酵液中小分子代谢产物提取的影响,并探讨了所筛选絮凝剂的使用条件。比较了4种固液分离方法对细菌发酵液的分离效果,进而确定了适合海洋细菌发酵液快速预处理的工艺。结果表明：硫酸铝耦合膜超滤法絮凝速度快、蛋白多糖去除率高、滤液澄清度好,不会造成粗提物中铝离子的残留量增加,适用于大部分海洋细菌发酵液的预处理。最佳使用pH值为6,在25℃-45℃之间温度对其影响不大,发酵液中蛋白含量与硫酸铝用量存在一定的关系。通过验证,此法对放线菌发酵液预处理也是适宜的。第二：以提取质量和HPLC指纹图谱为依据,对3类不同类型的13种大孔吸附树脂进行了筛选,以及组合搭配,通过质谱分析探究将筛选出的3种不同类型的树脂串联吸附是否具有优势,最后以254nm吸光值变化趋势和HPLC跟踪分析对串联树脂的吸附以及解吸条件进行了初步探索。结果表明：将非极性大孔吸附树脂DM11,中极性树脂HPD400和极性树脂SD3003种不同类型的树脂串联,可以尽可能多的吸附发酵液中的小分子代谢产物,并可以节约树脂用量。DM11:HPD400:SD300较适宜的搭配比例约为2：2：3；确定的吸附条件为：吸附温度为5℃,吸附pH值为5,上样流速为4BV/h时较适宜,放线菌上样量约为10BV,细菌约为32BV。确定的洗脱条件为：初步分段梯度点的甲醇水比例约为50：50；洗脱体积为水洗2BV、20%甲醇洗2BV、50%甲醇洗1.8BV、纯甲醇洗2BV；洗脱流速为1.5BV/h较适宜。第3：以分离度与分辨率为依据,从易分离极性化合物的四种高效液相分析色谱中筛选出了适宜的色谱柱,并对所筛选色谱柱的梯度条件进行了优化。结果表明：柱4(NMUC18,4.6×250mm,5μ)适合分离海洋微生物发酵液粗提物,采用梯度条件3能较好的兼顾极性部分与非极性部分化合物的分离。并采用HPLC-PDA-ELSD和UPLC-PDA-Q-TOFMS两套分析检测系统分别对粗提物进行指纹图谱表征,给出尽可能多的物化信息。第四：以色谱峰的可重现性、色谱柱装填的可重复性以及色谱峰的分离度和峰形为指导依据,对干法与湿法两种制备柱装填方法的柱效进行了考察；以尿嘧啶、硝基苯和芴3种标准品对分析柱和制备柱进行柱效评价,对分析条件与制备条件的转化进行了初步探究；以发酵液粗提物为对象考察了26×460mm制备柱的上样量；最后对分段制备是否可解决分离度的问题做了初步的考察。结果表明：制备柱采用干法装填的效果比较好；26×460mm的制备柱适宜的流速为40mL/min,起始梯度有机溶剂比例相对分析条件极性部分需下调5%-10%,非极性部分约下调5%,梯度运行时间可根据公式4-4进行转化；为保证一定的分离度,粗提物的上样量不超过3g比较适宜。
【作者】廖云莉；
【导师】徐洵；许晨；
【作者基本信息】厦门大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】海洋微生物；小分子代谢产物；预处理；大孔吸附树脂；制备；

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